人脱落乳牙干细胞骨向分化相关分子Runx2的动态表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.15.009

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (15): 2345-2350.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.15.009

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人脱落乳牙干细胞骨向分化相关分子Runx2的动态表达

王立媛^1，2，刘大勇¹，贾智¹

¹天津医科大学口腔医院，天津市 300070，²天津市口腔医院，南开大学口腔医院，天津市 300041

出版日期:2014-04-09 发布日期:2014-04-09
通讯作者: 贾智，天津医科大学口腔医院，天津市 300070
作者简介:王立媛，女，1973年生，天津市人，汉族，2010年天津医科大学口腔医学院毕业，硕士，副主任医师，主要从事牙体牙髓干细胞研究。
基金资助:
天津市高等学校科技发展基金计划项目(20110139)

Dynamic expression of Runx2 gene profile during osteogenesis in stem cells from human exfoliated deciduous teeth

Wang Li-yuan ^{1, 2}, Liu Da-yong¹, Jia Zhi¹

¹Dental Hospital, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China; ² Tianjin Stomatological Hospital, Stomatological Hospital of Nankai University, Tianjin 300041, China

Online:2014-04-09 Published:2014-04-09
Contact: Jia Zhi, Dental Hospital, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China
About author:Wang Li-yuan, Master, Associate chief physician, Dental Hospital, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China; Tianjin Stomatological Hospital, Stomatological Hospital of Nankai University, Tianjin 300041, China
Supported by:
Scientific and Technology Development Project of Universities in Tianjin, No. 20110139

摘要/Abstract

摘要：

背景：Runx2被认为是成骨基因表达的主要调节因子，是一种向成骨细胞分化的不可或缺的转移因子，在成骨细胞发育、分化、调控、骨钙化形成及骨修复过程中起着极其重要的作用。
目的：观察人脱落乳牙干细胞生物学特征，探讨乳牙干细胞骨向分化潜能，以及不同时间点成骨相关转录因子Runx2的动态表达规律。
方法：体外分离、培养人脱落乳牙干细胞。流式细胞仪检测乳牙干细胞表面标志。体外脂向诱导分化4周后进行油红O染色，检测脂滴形成情况；矿化诱导21 d进行茜素红染色，检测矿化结节形成情况。于成骨诱导的不同时间点，用RT-PCR技术检测Runx2的动态表达。
结果与结论：通过酶消化法和有限稀释法获得了乳牙干细胞，流式细胞仪检测显示CD146和STRO-1均有不同程度的表达。成脂诱导油红O染色可见橙红色阳性颗粒。矿化诱导茜素红染色呈阳性。RT-PCR技术检测Runx2在成骨诱导第0天已有表达，0-6 d成明显增强趋势，6-12 d显著下降，12-18 d表达再次上升，以后相对平稳。结果表明乳牙干细胞可体外分离、培养，表达间充质干细胞表面标志，具有成脂和成骨向分化能力。Runx2在乳牙干细胞成骨分化各阶段均有表达，早期和晚期表达上升，中期表达有下降趋势。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 骨组织工程, 人脱落乳牙干细胞, Runx2, 骨向分化, 动态表达

Abstract:

BACKGROUND: Runx2 is considered to the main regulatory factor of osteogenic gene expression and be necessary for osteoblast differentiation, it plays an extremely important role in the osteoblast development, differentiation, regulation, bone calcification formation and bone repair.
OBJECTIVE: To observe the biological properties of mesenchymal stem cells from human exfoliated deciduous teeth, explore the osteogenic differentiation potential of deciduous teeth stem cells, and observe the dynamic expression of Runx2 gene at varying time points.
METHODS: The stem cells from human exfoliated deciduous teeth were isolated and cultured in vitro. The cell surface antigen was detected with flow cytometry. The third passage cells were cultured in the adipogenic medium for 4 weeks, and oil red O staining was conducted to test lipid droplets formation. The third passage cells were cultured in the osteogenic medium for 21 days, and mineralized nodules were detected by alizarin red staining. Runx2 mRNA dynamic expression was detected with semi-quantitative RT-PCR at different time points.
RESULTS AND CONCLUSION: The stem cells from human exfoliated deciduous teeth were obtained by enzyme digestion and limited dilution methods. Flow cytometry results showed that, CD146 and STRO-1 were
expressed to varying degrees. Oil red O staining revealed salmon pink positive particles. Alizarin red staining showed positive expression. RT-PCR results showed that, Runx2 expression was found at day 0, up-regulated from day 0 to day 6, and subsequently dropped with an expression bottom at day 12, after that a second expression peak occurred at day 18, followed by a stably regulation. The stem cells from human exfoliated deciduous teeth can be isolated and cultured in vitro, express surface antigen of mesenchymal stem cells, and have the potentials of differentiating into adipocytes and ostetoblasts. Runx2 gene profiles are dynamically expressed during osteoblastic differentiation. Runx2 express throughout every stage of osteoblastic differentiation. The expression is up-regulated during early and later stages, and down-regulated in metaphase.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: tooth, deciduous, tooth exfoliation, stem cells, core binding factor alpha 1 subunit

中图分类号:

R318

王立媛，刘大勇，贾智.. 人脱落乳牙干细胞骨向分化相关分子Runx2的动态表达[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(15): 2345-2350.

Wang Li-yuan, Liu Da-yong, Jia Zhi. Dynamic expression of Runx2 gene profile during osteogenesis in stem cells from human exfoliated deciduous teeth[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(15): 2345-2350.

图/表（结果） 2

2.1 乳牙干细胞生长情况 人乳牙牙髓组织通过Ⅰ型胶原酶和dispase酶消化处理后，可获得单细胞悬液(图1A)。接种到培养瓶后，在倒置显微镜下观察，呈悬浮、折光性强的圆形细胞。细胞体积较小，胞浆均匀、明亮，边界光滑清晰。原代乳牙牙髓细胞接种约2 h后，即有细胞下沉固定不动，24 h后可见有细胞开始伸展(图1B)，48 h基本展开。完全展开的细胞呈多形性，大部分呈梭形，成纤维细胞状，体积较小，轮廓清楚；少数为多角形、纺锤状或椭圆形(图1C)。之后，少数几个细胞迅速增殖，呈巢式或集落状生长，细胞间排列紧密，境界不清，周边细胞呈短梭形，体积较小(图1D)，10-12 d细胞达到90%汇合。

苏木精-伊红染色观察可见胞核深染，卵圆形或圆形，胞核体积大，内可见一个或多个核仁，胞浆着色浅(图1E)。随着传代次数的增加，细胞的总数呈对数级上升。细胞明显呈编织状、放射状、漩涡状集落生长，形态趋于变长，呈牙髓成纤维细胞样(图1F)。

2.2 细胞表面抗原检测结果 STRO-1⁺占总细胞量的(20.01±1.62)%，CD146⁺占总细胞量的(92.51±1.34)%。

2.3 成脂诱导分化后油红O染色结果 成脂诱导体系培养4周，在相差显微镜下可见变大、变圆的胞体内有串珠样折光明显的脂滴。油红O染色可见橙红色阳性颗粒(图2A)。

2.4 成骨诱导细胞生长情况 诱导培养前2 d，在倒置显微镜下观察，细胞形态和数量没有明显变化。诱导培养4 d后，倒置显微镜下可观察到部分细胞体积增大，胞浆丰富，由原来的长梭形变为立方形，有些带有数个突起，呈星形、多角形。细胞排列呈一定的极性，少数有细长的突起。随着培养时间的延长，某些局部诱导后的细胞可重叠生长，呈结节状，随着细胞的不断增殖，最终铺满连成一片，可复层生长。

2.5 矿化结节形成能力 矿化诱导体系的作用下，前2 d生长缓慢，随后增殖加快，五六天单层长满皿底。八九天后，换液过程中发现较前阶段有较多的细胞漂浮死亡。10-12 d可观察到个别位置的细胞呈复层生长，透光性变差。15-17 d前后可见有散在的极细小沙粒样杂质贴敷培养皿底细胞表面，换液不能去除。行茜素红染色后，提示未经矿化诱导(0 d)的呈阴性(图2B)，经矿化液诱导21 d的呈阳性反应(图2C)，细胞内有钙盐沉积。

2.6 PCR检测结果 于成骨诱导不同时间点均可检测到成骨分化特异性转录因子Runx2在琼脂糖凝胶上400-500 bp之间有不同程度表达(图2D)。其在成骨诱导分化过程中的变化趋势可描绘成的一条平滑曲线(图2E)。0 d有微弱表达，0-6 d成明显增强趋势，6-12 d显著下降，12-18 d表达再次上升，以后相对平稳。

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引言

材料方法

设计：体外观察实验。

时间及地点：实验于2009年5月至2010年5月在天津医科大学基础实验中心完成。

材料：

实验方法：

乳牙干细胞的培养与纯化：6-10岁健康儿童因滞留而拔除的乳牙，无牙体牙髓疾病，由天津市儿童医院口腔科提供。拔牙前依次用2%碘酒、体积分数为75%乙醇及生理盐水清洁牙冠表面及邻近软组织。拔除后立即放入4 ℃预冷的，装有含高倍双抗的α-MEM不完全培养基或PBS的试管中保存备用，在4 h内进行原代取材。参考Gronthos等^[5]的方法，分离、培养、扩增细胞，获得乳牙干细胞。

形态学观察：原代及传代培养的细胞，逐日用倒置显微镜观察细胞的生长、增殖情况及形态特征并拍照。纯化的第2代细胞以3×10⁷ L^-1的细胞浓度接种到预置盖玻片的培养皿中，细胞铺满后取出盖玻片，苏木精-伊红染色，镜下观察细胞组织学特征。

流式细胞仪检测：当第2代乳牙干细胞生长融合成单层后，0.25%胰蛋白酶消化，PBS混悬后计数，保证每个上样管内细胞浓度为1×10⁹-1×10¹⁰ L^-¹，1 000 r/min离心 5 min弃上清，加入500 mL PBS，混匀后分别加入CD146-APC和STRO-1-APC各50 mL混匀，冰盒内避光孵育1 h后分别上机检测。

成脂分化诱导实验：参考Gimble等^[6]文献。将培养的第3代乳牙干细胞以1×10⁵/孔的密度置于6孔板中培养，常规换液。当细胞融合至90%时，更换成脂诱导液(在含有体积分数为20%胎牛血清的α-MEM培养基中，加入终浓度为0.5 mmol/L IBMX、0.5 μmol/L氢化可的松、10 μmol/L胰岛素、60 μmol/L吲哚美辛和50 μmol/L庆大霉素)，每3 d换液1次，诱导期间每日在相差显微镜下观察细胞形态变化，观察细胞内形成脂滴情况，4周后油红O染色。

成骨诱导培养及矿化结节形成能力的检测：将对数生长期，状态良好的第3代乳牙干细胞，以2×10³/cm²的密度接种到直径3 cm的培养皿中。24 h后细胞完全贴壁，待细胞长满培养皿底70%-80%时，更换原培养液为矿化诱导液(含体积分数为10% 胎牛血清的α-MEM培养基中加入终浓度为1×10^-8mol/L的地塞米松、50 mg/L的β-甘油磷酸钠、10 mmol/L的维生素C)，在37 ℃、体积分数为5% CO₂孵箱中继续培养，每2 d换液1次。每天在倒置显微镜下观察细胞形态和生长规律的变化并照相。分别于诱导后第0天和第21天各取一个培养皿，做茜素红染色，观察钙化结节形成情况。

半定量RT-PCR检测Runx2的表达：对数生长期状态良好的第3代乳牙干细胞，以2×10³个/cm²的密度接种到直径3 cm的培养皿中。24 h后细胞完全贴壁，待细胞长满培养皿底70%-80%时，更换原培养液为矿化诱导液，孵箱中继续培养，每2 d换液1次。分别于成骨诱导的第0，3，6，9，12，15，18，21天取2个培养皿，用PCR技术检测Runx2的表达，GAPDH为内参。2%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，数码照相并采用Quantity One^® User Guide for Version 4.6.2 Windows and Macintosh软件对灰度值进行分析。

PCR引物序列由上海生工生物工程有限公司合成：Runx2引物序列：上游：5’-acc aga tgg gac tgt ggt tac t-3’，下游：5’-gga tta aaa gga ctt ggt gca g-3’，扩增产物为393 bp。

主要观察指标：①乳牙干细胞形态。②乳牙干细胞表面抗原表达。③乳牙干细胞成脂、成骨分化能力。④乳牙干细胞成骨相关转录因子Runx2的表达。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

随着干细胞研究的发展，人们发现具有多向分化潜能的间充质干细胞还存在于口腔组织的牙髓、牙周膜、牙胚、口腔上皮^[7-14] ，以及血液、肌肉、成人膝关节滑膜、皮肤结缔组织等组织中。本实验以人乳牙牙髓为研究对象，根据Miura等^[1]和Gronthos等^[5]的报道，使用Ⅰ型胶原酶和dispase酶共同消化的方法，使有限的乳牙牙髓组织得到充分利用，获得人脱落乳牙干细胞。
采用有限稀释法进行克隆化培养，得到克隆化生长的乳牙牙髓细胞，细胞爬片苏木精-伊红染色，光镜下可见乳牙干细胞呈短梭形，细胞体积小，核大，着色深，卵圆形，核浆比例大，有1个或多个核仁，核仁明显，胞质着色浅，为低分化细胞形态。形态反映功能，说明体外分离培养的乳牙干细胞在一定时间内仍能保持其未分化状态。20代后，乳牙干细胞仍保持增殖能力。平均四五天传代1次，形态趋于一致，各代之间形态单一，为成纤维细胞样细胞，未见明显生长减缓，具有自我更新的干细胞特点。细胞间排列为漩涡状，这是间充质干细胞特有的排列方式。
目前对乳牙干细胞的鉴定主要通过观察其克隆样生长和多向分化的特性，此外还有早期间充质干细胞表面的多项标志物，基质细胞抗原STRO-1和CD146表达的检测结合进行综合判断^[15-16] 。STRO-1是表达在骨髓基质细胞和红细胞前体上的一种细胞表面蛋白，是间充质干细胞常用表面标志物。实验应用流式细胞仪检测STRO-1和CD146在乳牙干细胞中的阳性表达率。结果可见：STRO-1⁺约占总细胞量(20.01±1.62)%，CD146⁺占总细胞量的(92.51±1.34)%。证实其为间充质来源的干细胞。
目前普遍认为，干细胞骨向分化主要经过细胞增殖分化，骨质基质分泌，骨质基质成熟和矿化等几个阶段。受到诸多因素调控，包括激素^[17] 、生长因子、细胞外基质、机械力^[18-20] 、转录因子及Micro-RNA等，这些因素共同发挥作用，调控干细胞骨向分化的不同阶段^[21-22] 。Runx2是骨细胞中最早被鉴定出来的转录因子之一，是成骨细胞系必需的特异性转录因子，可调控众多基因的转录^[23] 。它能调控干细胞成骨分化的早期阶段或者是其他非成骨细胞向成骨细胞的分化^[24] ，在成骨细胞形成和分化、软骨细胞的分化和成熟、骨发育过程中血管入侵、破骨细胞形成和吸收及骨基质蛋白产生中发挥重要作用^[25-27] 。Runx2既与成骨细胞分化相关也是软骨细胞肥大化过程所必需的^[28-29] 。Runx2蛋白包含许多结构域通过共激活子或者共抑制子调节转录激活或抑制^[30] 。Runx2磷酸化可以负向调节其转录活性，这是通过磷酸化不同氨基酸残基实现的^[31] ，组蛋白乙酰化酶抑制剂能够促进Runx2活性，从而上调成骨分化促进新骨形成^[32-33] 。Runx2被公认为是一种向成骨细胞分化不可或缺的转移因子，在成骨细胞发育、分化、调控和骨钙化形成、骨修复过程中起着极其重要的作用。Runx2基因的表达可以作为检验成骨细胞分化的标志^[34-35] 。
本实验将对数生长期状态良好的第3代脱落乳牙牙髓干细胞，以2×10³/cm²的较低密度接种到培养皿中，24 h贴壁，未等细胞完全融合长满即更换为成骨诱导液，是因为有研究显示：在成骨诱导分化过程中，成骨前体细胞的高度复制扩增特性极大的依赖于细胞密度^[36] 。较低密度接种为成骨前体细胞扩增提供足够的空间，以便接下来细胞接触产生细胞外基质，为骨向分化开启最佳的信号通路^[37] 。实验结果显示于成骨诱导不同时间点均可检测到Runx2不同程度的表达。0-6 d细胞增殖阶段Runx2的表达成明显增高趋势，第6天细胞长满后，进入到细胞成熟期，Runx2的表达水平成明显下降趋势。提示Runx2存在于积极分裂的成骨细胞前体细胞中并在细胞由增殖转向分化时表达最高，表明Runx2参与了成骨细胞增殖分化调控。而在细胞成熟基质形成阶段受到抑制其表达水平下降。大约12 d以后进入矿化期，表达水平逐渐升高，后保持相对平稳的水平，提示Runx2在基质矿化期抑制因素解除或减弱，受正调控。这与某些成骨细胞系的研究基本一致^[36,38] 。表明Runx2活性可以在转录后水平上受到调控。
实验显示，人脱落乳牙干细胞在成骨诱导分化第0天，Runx2也会有一定程度的表达，这是因为Runx2是一类调控间充质干细胞定向分化的特异性转录因子，其在牙胚细胞分化^[39] 、牙体组织形成^[40-41] ，以及牙齿的萌出过程中均发挥着重要的作用^[42] 。Runx2在人恒牙和乳牙牙髓组织、牙髓干细胞中均有表达^[43] 。
研究结果表明，乳牙干细胞可体外分离、培养，表达间充质干细胞表面标志，具有较强的倍增能力及克隆形成能力，具有成脂和成骨向分化能力。Runx2在乳牙干细胞成骨分化过程中成动态表达，成骨分化各阶段均有表达，早期和晚期表达上升，中期表达有下降趋势。期望能为后续的乳牙干细胞在体内参与骨组织修复与再生的基础研究提供一定的参考依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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[3]	陈崧, 何远丽, 谢雯佳, 钟林娜, 王剑. 磷酸钙纳米颗粒药物递送系统在骨组织工程研究与应用中的优势[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3565-3570.
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[5]	许辉, 康冰心, 钟声, 高晨鑫, 赵翅, 邱国伟, 孙松涛, 解骏, 肖涟波, 施杞. 点按局部腧穴与坐位调膝法联用治疗膝关节骨关节炎：随机对照研究[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 216-221.
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[8]	李晏乐, 岳肖华, 聂真, 张峻玮, 李朝辉, 聂伟志, 姜红江. 生物可吸收材料特点及在骨科中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(16): 2612-2617.
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[15]	黄慧, 戴瑶, 李永生, 陈微, 唐芳, 黄宇婷, 周征, 刘海蓉. 非编码RNA在骨组织工程细胞与支架构建中的研究与应用[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(4): 596-605.